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Aβオリゴマーに対する新たな取り組み

 

Wiki の 「アルツハイマー型認知症の生化学」 にも、

『最近になって広く支持されているアミロイド仮説の一つにオリゴマー仮説がある。

神経毒性をもつ物質はアミロイドβのミスフォールド中間体であり、それは可溶性の単量体でも成熟した線維状ポリマーでもなく、おそらくドーナツ型か星型で真ん中にチャネルを持つオリゴマーである、という仮説である[25]。』

と記載されているように、アミロイド斑ではなく可溶性のオリゴマーとアルツハイマー病との関連性を報告するレポートは数多く発表されています。

けれども、多数存在する形態のどのオリゴマーが人間のアルツハイマー病に最も関連しているのかに関しては、中々結論が出ないようです。

 

AlzForum では第14回アテネ/スプリングフィールド国際アルツハイマー病先端治療シンポジウムを特集しています(⇒ International Athens/Springfield Symposium on Advances in Alzheimer Therapy, 2016)けれども、パート2はこのオリゴマーがテーマです。

 

 

 ⇒ New Tack on Aβ Oligomer Role in Disease and Treatment

       疾患と治療におけるAβオリゴマーの役割に関する新たな方針

 

 

 

 

 

可溶性のオリゴマーアルツハイマー病Alzheimer's diseaseAD)において最も有毒な形態のアミロイドβタンパク質)だという証拠が積み上がっている通り、研究者達はこの種(species)を特徴付け標的化する最適な方法に取り組んでいるところだ。

 

3月9日から12日に掛けてギリシアのアテネにおいて開催された第14回アテネ/スプリングフィールド国際アルツハイマー病先端治療シンポジウム(14th International Athens/Springfield Symposium on Advances in Alzheimer Therapy)のプレゼンテーション(発表)が証拠立てているように、進展は遅くブレイクスルー(現状突破)には中々手が届いていない。

 

研究者達はAβオリゴマーが神経原線維変化Neurofibrillary tangle)から物理的に分離したということを示すデータの断片を提示し、この2つが一緒にではなく夫々単独で脳内に広がっていることを示唆している。

別の研究者達はAβオリゴマーがタウの過剰リン酸化とミスソーティング(missorting:誤った局在化、誤った選別輸送 )を引き起こし得るシグナル伝達経路や、それらを治療標的とし得る抗体を特定していた。

 

「確かにオリゴマーは治療標的だ。」 とセントルイスにある ワシントン大学Washington University in St. Louis)の  John Morris は Alzforum に書いている。

「しかしアミロイド斑や神経原線維変化とオリゴマーとの正確な結び付きは未だに究明されていない。」 と彼は強調している。

彼はこれらの研究には関与していなかった。

 

 

研究者達は長い間、アミロイド斑と神経原線維変化がどのように相交わるのかに付いて頭を悩ませてきた。

これらは脳内において疾患の異なる段階のしかも異なる部位において形成されるからだ(⇒ Thal et al., 2014:Spreading of amyloid, tau, and microvascular pathology in Alzheimer's disease: findings from neuropathological and neuroimaging studies.)。

 

可溶性のオリゴマーと神経原線維変化との間には、密接な関連性があるのだろうか?

 

これまでのところでは、Aβオリゴマー及びその脳内の部位に関するデータの多くは動物研究によりもたらされている。

しかしこの会議を共催したジュネーブ大学病院(Geneva University Hospitals)の Ezio Giacobini は、人間の脳ではどこにオリゴマーが現れ他のタンパク質の病理とどのように関連しているのかを知りたいと思った。

彼は、病理学的に軽度から中等度のアルツハイマー病と確認された30名の高齢者と認知正常なコントロール(対照)43名の死後脳組織を調べた。

免疫組織化学(免疫染色Immunohistochemistry)による検出では、タウの神経原線維変化にAT8が、アミロイドに4G8、Aβオリゴマーには合成Aβオリゴマーを特異的に認識する抗体NU1が使用された。

オリゴマーとアミロイド斑はAD患者の嗅内皮質(嗅内野Entorhinal cortex)に同時に現れていたが、一方神経原線維変化は海馬Hippocampus)に出現していた。

 

 

この結果は特定のオリゴマーがタウ病理を引き起こす可能性が低いことを示唆している、とミネソタ大学ミネアポリスキャンパス(University of Minnesota, Minneapolis;⇒ ミネソタ大学ツインシティー校)の Karen Ashe は述べている。

しかしながら、オリゴマーの一部の形態では可能性があるということに彼女は言及している。

Ashe はつい先日、オリゴマーが2つの主要なクラスに分類されるということを報告している。

タイプ1はモノマー単量体)から形成され脳全体に分布するが、一方タイプ2はその形成に触媒作用を及ぼすアミロイド斑近傍に出現する(⇒ June 2015 news:Two Classes of Aβ Oligomers Act Differently in the Brain)。

アミロイド斑周囲の染色パターンに基くと NU1はタイプ2のオリゴマーを標識するように思われる、と Ashe は述べている。

 

それは確実ではない、と Giacobini は述べている。

この結果は、タイプ1のオリゴマーが神経原線維変化と共局在し得るという可能性を残している、と Ashe は述べている。

解明するためにはタイプ1に特異的な抗体が必要だが、どれ1つとして利用できるものはない、と彼女は述べている。
異なったオリゴマー種を標識して脳全体の分布の全容を把握するためには複数の抗体が必要だ、とミネソタ大学ミネアポリスキャンパスの Sylvain Lesné は同意している。

 

 

Giacobini は引き続いて ウェスタンブロッティング により人間の脳組織を調べた。

アミロイド斑の認められるコントロール(対照)と認められないコントロール、AD患者の(夫々の)抽出物において彼は55kDa(キロダルトン;⇒ 統一原子質量単位)にNU1陽性のバンドが出現することを見出した。

AD患者では、側頭皮質(temporal cortex)におけるこのタンパク質がコントロールよりも40%多かった。

このオリゴマーは健康な人々に認められるので脳内における正常な存在であり何らかの機能を有していると考えている、と Giacobini は Alzforum に述べている。

通常はアミロイド斑が認められない小脳Cerebellum)の抽出物においてこれが検出されたが、彼はそれが疾患において毒性のレベルに達すると推測している。

(その)サイズを基にするとこの55kDaのタンパク質は14量体ということもあり得るが、Giacobini は Ashe のグループが単離したAβ*56(※Aβstar56;⇒ Aβ Star is Born? Memory Loss in APP Mice Blamed on Oligomer)のような12量体かも知れないと話している。

Aβ*56はTg2576ADマウスモデルにおいて認知低下と一致し、人間では脳脊髄液CSF)中の神経変性マーカーと相関している(⇒ Lesné et al., 2006:A specific amyloid-beta protein assembly in the brain impairs memory. ; Lesné et al., 2008:Plaque-bearing mice with reduced levels of oligomeric amyloid-beta assemblies have intact memory function. ; Zahs and Ashe, 2013:β-Amyloid oligomers in aging and Alzheimer's disease.)。

 

Lesné はこの研究には関与していなかったが、Giacobini が確かめたこの55kDaのバンドはAβ*56ではないかも知れない、と警告している。

Aβ*56と同じような分子量の別のオリゴマーかも知れないし、アミロイド前駆体蛋白質APP)の切断フラグメント(断片)ということもあり得る、と彼は述べている。

Lesné が死後脳組織のAβ*56を測定した時には、この55kDaのオリゴマーとは違ってコントロールと比較してADで顕著に減少していた(⇒ Lesné et al., 2013:Brain amyloid-β oligomers in ageing and Alzheimer's disease.)。

 

Lesné の方では、ニューロンに対するAβオリゴマーの影響を詳しく調べているところだ。

研究者達は以前、合成Aβオリゴマーがタウの過剰リン酸化と樹状突起へのミスソーティングを引き起こすことを報告している(⇒ Sep 2010 news:The Plot Thickens: The Complicated Relationship of Tau and Aβ;Zempel et al., 2010:Abeta oligomers cause localized Ca(2+) elevation, missorting of endogenous Tau into dendrites, Tau phosphorylation, and destruction of microtubules and spines.;De Felice et al., 2008:Alzheimer's disease-type neuronal tau hyperphosphorylation induced by A beta oligomers.)。

 

アテネで Lesné は、このプロセスにおいてAβ*56が同様に役割を果たしていることを示唆するデータを提示した。

初代培養皮質ニューロンのシナプスではこのオリゴマーがNMDA受容体NMDA receptor;⇒ NMDA型グルタミン酸受容体)と結合していることを、彼は見出した。

 

これは受容体イオンチャネル を開いてカルシウムイオンの流入を許可し、カルシウムカルモジュリン依存性タンパク質キナーゼ(Ca2+-dependent calmodulin kinase)(CaMKIIα)を活性化させる。

次には CaMKIIα がタウのセリン416(※416位のセリン)のリン酸化を倍増させる。

タウも同様に、ニューロンの樹状突起の区画(compartment)にミスソート(missort)される。

内因性の阻害物質CN21を用いたCaMKIIα の阻害は、タウを過剰リン酸化とミスソートから防いだ

(※CN21は Ca+2/calmodulin-dependent protein kinase II inhibitor 2 (CaM-KII inhibitory protein, CaM-KIIN) (CAMK2N2) 由来のアミノ酸配列 ”KRPPKLGQIGRSKRVVIEDDR” で、「Improving a Natural CaMKII Inhibitor by Random and Rational Design」によるとCaMKIIを抑制するCaM-KIINの完全な能力(有効性)を持っているようです。

『Previous studies showed that the 21 mer CN21 (Fig. 1A) contains the inhibitory region of CaM-KIIN, as it retains full potency of CaMKII inhibition [35].』

CaM-KIINのCaMKII抑制領域は当初27アミノ酸配列のCN27(CaMKIINtide)に含まれていることが示され、その後21アミノ酸に絞られこれがCN21ということのようです。

『The CaMKII inhibitory region of CaM-KIIN was initially shown to be contained within a 27 amino acid sequence [1], [2], then further narrowed down to 21 amino acids [35].

The corresponding CN inhibitor peptides CN27 (also known as CaMKIINtide) and CN21 provided important new research tools [19], [34], [36], [39], [40].

They are more selective than the traditional KN inhibitors of CaMKII [1], [35], which additionally inhibit CaMKIV [41] and voltage gated Ca2+ and K+ channels [42], [43].

More importantly, KN inhibitors are competitive with CaM and inhibit only stimulated but not autonomous activity of CaMKII [36], [44], [45], and thus do not allow probing the specific functions of this hallmark feature of CaMKII regulation.』)

 

Lesné は、Tg2576マウスとJ20マウスにおいて活性化CaMKIIα の同様の増加を確かめている。

彼はまた、認知正常な高齢者の死後脳の下側頭回Inferior temporal gyrus)においてCaMKIIα の増加をも検出している。

 

 

「我々はこの結果がADリスクのある高齢被験者の下側頭回に認められるタウ病理を説明し得ると考えている。」 と Lesné は Alzforum に書いている。

これはAβとタウ病理との間のもっともらしく思われる関連性の1つだ、と Giacobini は述べてはいるものの、これらの結果の大部分はトランスジェニックマウスによってもたらされたものだということを彼は指摘している。

 

 

他の受容体と相互作用し別の方法でタウを変化させるAβのオリゴマー種が複数存在している可能性が高い、と Lesné は指摘している。

彼は以前、Aβの二量体が細胞型プリオンタンパク質と結合し、これが Src キナーゼFYN と結合して活性化させその結果これがタウを過剰リン酸化するということを報告している(⇒ Larson et al., 2012:The complex PrP(c)-Fyn couples human oligomeric Aβ with pathological tau changes in Alzheimer's disease.)。

ニューロンに対する様々なオリゴマーの固有の影響が疾患の個々の段階において優勢となる可能性がある、と彼は付け加えている。

以前に彼は、Aβの2量体や3量体、Aβ*56オリゴマーの相対的存在量が年齢や疾患と共に変化することを見出しているからだ(⇒ Lesné et al., 2013:Brain amyloid-β oligomers in ageing and Alzheimer's disease.)。

 

 

様々なオリゴマー種を治療的に標的とすることが出来る抗体を詳しく調査している研究者もいる。

イリノイ州エバンストンにあるノースウェスタン大学Northwestern University, Evanston, Illinois)の William KleinAcumen Pharmaceuticals を共同設立し、そこの研究者達と協力して ACU-193(以前の19.3)と呼ばれているオリゴマー特異的抗体を開発した。

これは、Klein の研究室で開発された手順(procedure)により生成された可溶性の合成AβオリゴマーADDL(Abeta-derived diffusible ligand:Aβ由来拡散性リガンド;⇒ Abeta toxicity in Alzheimer's disease: globular oligomers (ADDLs) as new vaccine and drug targets.)に対して作成されたマウスの抗体の人間用の(humanized:ヒト化)バージョンだ。

(※合成Aβオリゴマーの作成手順は「Monomerization of Aβ peptide」参照)

彼らのデータではACU-193がタイプ1とタイプ2の何方のオリゴマーにも結合するがAβモノマー単量体)や原線維とは結合しないことが示されている、とAcumen社の William Goure は Alzforum に書いている。

 

アテネで Klein はこの抗体に関する前臨床データを提示し、オリゴマーの亜種(subspecies)を選択的に標的とする一連の単鎖可変領域抗体(single-chain variable fragment antibody)を発表した。

培養海馬ニューロンにおいては、ACU-193はチオフラビン陽性のアミロイド斑とは結合しなかった。

これはやはりオリゴマーと結合して膜との相互作用を妨げ、長期増強Long-term potentiation LTP)やオリゴマーの誘発するカルシウム過負荷を回復させた。

Tg2576マウスでは、年齢とは無関係に静脈内投与されたACU-193は同様にオリゴマーと結合した。

Aβに対する治療的抗体の幾つかで発生した副作用の微小出血は、これでは生じなかった。

行動試験では、ACU-193のマウス前駆物質ACU-3B3オープンフィールドテストY-迷路試験におけるJ20マウスの活動亢進やプラットフォーム(逃避台)が見えている状態のモリス水迷路試験における学習障害を回復させたが、プラットフォームが(※白濁した水面下にあり)見えないバージョンでは回復させなかった。

マウスやラット、犬、アカゲザルの脳内には十分な抗体が(※血液脳関門Blood–brain barrierBBBを越えて)入ったことが 免疫蛍光染⾊(免疫蛍光法)により検出され、ナノモル濃度の(※低)親和性でAβオリゴマーと結合した、と Klein は述べている。

 

 

この企業は人間のADの死後組織において結合を直接調べてはいないと Goure は書いているが、しかしチャールズタウンにあるマサチューセッツ総合病院(Massachusetts General Hospital in Charlestown)の Brian Bacskai と同僚は死後AD脳組織に由来する可溶性オリゴマーがACU-3B3と結合することを見出している、と Klein は述べている。

Klein と同僚は以前、ACU-193とACU-3B3が人間の脳脊髄液中のオリゴマーと結合し、AD患者では更に多くのオリゴマーが検出されることを報告している(⇒ Savage et al., 2014:A sensitive aβ oligomer assay discriminates Alzheimer's and aged control cerebrospinal fluid. ; Yang et al., 2015:A highly sensitive novel immunoassay specifically detects low levels of soluble Aβ oligomers in human cerebrospinal fluid.)。

これらの肯定的な前臨床の結果や良好な安全性データを所与としてACU-193の臨床試験に思いを巡らして資金調達しているところだ、と Klein は述べている。

 

 

どの形態のオリゴマーがアルツハイマー病と関連しているのかに付いての不確定が何時までも残っていることを考えるとこの抗体が人間で効果があるのかどうか、疾患のどの段階において最も効果的なのかを知るのは難しい、とGiacobini は述べている。

 

Ashe も同意している。

「全てのオリゴマーが必ずしもよく似ているというわけではなく、2つ以上のタイプが存在するという見解が受け入れられ始めて来ている。」と彼女は Alzforum に述べている。

「異なった種類のオリゴマーに付いて更に理解し、タイプ1とタイプ2の何れを(或いは何れをも)標的とするのかどうかという観点から抗体を特徴付けることが重要だ。」

 

ミズーリ州セントルイスにある ワシントン大学Washington University in St. Louis, Missouri) の David Brody も同意している。

「人間の脳にはどのオリゴマーが存在しているのかに関しては多くの議論があり、合成や細胞培養、トランスジェニックマウスに由来する多くの種類は人間において観察されているものとは全く異なっているように思われる。」 と彼は述べている。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ACU-193(19.3)とACU-3B3(ACU-921)に関しては、「A Sensitive Aβ Oligomer Assay Discriminates Alzheimer's and Aged Control Cerebrospinal Fluid」 の Materials and Methods に説明があります。

 

『Human IgG2 antibody 19.3 was modified from a mouse monoclonal (3B3) and demonstrated selectivity for oligomers versus either monomeric or fibrillar Aβ (U.S. Pat. Nos.7,811,563 and 7,780,963).

Mouse monoclonal antibody, 3B3 (also known as ACU-921), was generated by immunizing mice with Aβ1–42 ADDL oligomers mixed 1:1 with either Freund's (first and second vaccine, subcutaneously) or incomplete Freund's adjuvant (all subsequent vaccinations, intraperitoneal).

Each injection consisted of oligomers equivalent to 194 ± 25 μg of total protein.

Subsequently, the mouse clone 3B3 was converted to a human IgG2 antibody.

Variable heavy and light chain domain regions of 3B3, encoding the Aβ oligomer binding domain, were sequenced and cDNA encoding these complementarity-determining regions were introduced in a human IgG2 context.

An affinity maturation library was generated with variable heavy and light chain domains of 3B3 introduced within the pFab3D phage display vector.

Ligation products were transfected into Escherichia coli TG1 cells, phage culture supernatants were concentrated, and aliquots were made for phage library panning, conducted using biotinylated Aβ42 ADDL oligomers.

Phages bound to biotinylated ADDLs were eluted and added again to E. coli TG1 cells.

Biotinylated ADDLs were prepared using methods noted above (Shughrue et al., 2010), but starting with N-terminal biotinylated Aβ42 peptide (American Peptide).

Phage supernatants (100 μl) were used for analysis in one-site ELISAs using either Aβ monomers, oligomers, or fibrils (data not shown), and 19.3 was selective for oligomers.』





















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[ 2016/04/26 01:40 ] アルツハイマー | TB(0) | CM(3)
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